Published on Mai 5, 2020 by

3D gedurckter PCR Thermocylcer mit Arduino-Steuerung

Zusammenfassung

PCR-Geräte sind teuer. Selbst die einfachsten Modelle starten ab $600. Da die Reaktion über eine Temperaturregelung sehr einfach zu steuern ist und die Komponenten günstig zu besorgen sind, wird in diesem Projekt ein ansprechender, funktioneller und günstiger PCR Thermocycler gebaut. Als Heizelemente werden umwickelte Widerstände benutzt. Das Gehäuse wird aus ABS-Kunststoff 3D gedruckt und der Aluminium-Heizblock in mehreren Teilen auf einer 3-Achs CNC-Fräse gefertigt. Zur Vereinfachung der Benutzerinteraktion wird auf ein Nextion Touch-Display zurückgegriffen. Die Materialkosten bleiben dabei jedoch konsequent unter $100.

Achtung: Dieses Projekt ist noch nicht abgeschlossen!

Einleitung

Vaterschaftstests, Erbkrankheiten und Virusinfektionen. Für die Aufklärung dieser und weiterer gentechnischer Fragestellungen ist die Erfindung der Polymerase Kettenreaktion (PCR) aus dem Jahre 1983 von Kary B. Mullis nicht mehr wegzudenken. Die Entschlüsselung des menschlichen Genoms bis zum Jahre 2003 wäre ohne diese Technik schlicht nicht möglich gewesen. Die Anwendung der PCR stellt heute einen essenziellen Schritt einer Vielzahl molekular-biologischer Arbeitsabläufe dar.

Durch einen definierten Zyklus aus Aufheiz- und Abkühlvorgängen können bestimmte Desoxyribonucleinsäure-Sequenzen (DNA) von Interesse im Zusammenspiel mit bestimmten Reagenzien exponentiell vervielfältigt werden. Erst dadurch ist ein qualitativer Nachweis und Vergleich möglich.

image/svg+xml 30 s 94 °C 72 °C 54 °C 25 s > 60 s Temp. Timeper step Denaturation Annealing Elongation
Abbildung 1 | Schema eines einzeln Zyklus der PCR Reaktion. Dieser Zyklus wird ca. 30 mal wiederholt.

Der iterative Mechanismus verläuft wie folgt: Bei 94 °C wird das zuvor isolierte DNA-Fragment über 30 s mittels Hitze in seine beiden Einzelstränge gespalten (Denaturierung). Bei ca. 54 °C erfolgt danach für ca. 20 s – 30 s die Anlagerung eines DNA-Primers (Annealing) an die zuvor aufgetrennten Stränge. Wird die Temperatur nun auf 72 °C angehoben bindet die Polymerase, genauer die Taq-Polymerase, an die Primer und komplettiert die Einzelstränge mithilfe freier Nukleotide wieder zu einem neuen Doppelstrang (Elongation). Die Dauer hängt dabei stark von der Sequenzlänge ab. In der Regel wird mit einem Wert von 60 s pro 1000 Basenpaare gerechnet. Aus Anfangs einem Doppelstrang sind nun zwei Doppelstränge geworden. Der Zyklus wird nun ca. 30 mal wiederholt, um eine ausreichende Menge an Kopien der Ausgangssequenz zu erhalten. Zusätzlich zum in Figure 1 dargestellten Zyklus erfolgt ganz am Anfang vor dem Start des ersten Zyklus eine initiale, 5-minütige Denatuerierung. Zum Abschluss wird nach den Zyklen die letzte Elongation 5 Minuten durchgeführt und schließlich die Temperatur auf 4 °C abgesenkt, um die eingesetzten Enzyme zu inaktivieren.

Mittlerweile wurde die Methode vielfach optimiert und weiter entwickelt. Mit der qPCR (Real-Time-PCR), welche durch den Einsatz von Farbstoffmolekülen in Echtzeit den Fortschritt der Amplifikation anzeigen kann, wurde die herkömmliche PCR im Laboralltag abgelöst. Für einfache Nachweise finden sich in Forschungs- und Universitätslaboren allerdings noch häufig diese konventionellen Thermocycler.

Der Aufheiz- und Abkühlprozess wird in kommerziellen Maschinen üblicherweise durch die Verwendung eines Peltier-Elements herbeifegührt. Dieses elektrothermische Halbleiterelement hat eine kompakte Bauweise, besitzt im Gegenzug allerdings – dem niedrigen Wirkungsgrad geschuldet – eine hohe elektrische Leistungsaufnahme.

In diesem Projekt soll ein kostengünstiger, kompakter PCR Thermocycler aus einfachen Komponenten konzipiert und gebaut werden. Das komplett aus ABS-Kunststoff 3D gedruckte Gehäuse hält mit einer Glastemperatur von über 100 °C den Anforderungen von max. 95 °C stand. Es wird mit einem 4.3″ TFT Nextion Touchscreen-Display ausgestattet, um autonom Benutzerinteraktionen zu ermöglichen und den aktuellen Prozessverlauf anzuzeigen (Der in diesem Fall relativ kostspielige Nextion Display lässt sich selbstverständlich auch gegen ein deutlich günstigeres LCD Display mit Encoder-steuerung austauschen, um Kosten zu sparen). Das Heizelement selbst besteht in diesem Projekt aus vier umwickelten Widerständen (á 1 kOhm), die über ein solid-state-relais (SSR) gesteuert werden. Der Regelkreis wird mit einem Temperaturfühler als Sensor ausgestattet, ein Arduino Uno dient als Mikroprozessor, um den Thermozyklus und die Benutzereingaben umzusetzen. Kernstück des Geräts stellen drei gefräste Aluminiumteile dar, die zusammen den Heizblock ergeben und mittels Zylinderstiften verbunden werden. Die Spannungsversorgung erfolgt über ein 12 V Netzteil, das 5 A liefert und den Mikrocontroller und damit auch das Display versorgt, aber auch die Lüfter. Ein anschließendes PID-Tuning stellt die Effizienz und Präzision der Temperaturzyklen sicher. Zur Überprüfung der Methode soll ein Gel-lauf den Erfolg der Amplifikation bestätigen.

Animation des Mechanismus für den Deckel. Der Deckel wird sicher verschlossen, während eine benutzerfreundliche Einhandbedienung gegeben ist. Ein versehentliches Öffnen ist unwahrscheinlich, die Wärme wird im Gerät gehalten und der Benutzer kann sich nicht an heißen Oberflächen verletzen. (Autodesk Inventor Professional 2019)
Thermische Analysesimulation bis zu 500 K. Die Simulation zeigt eine schnelle Erwärmung und Abkühlung. Die Wärme wird um die Außenseite des Blocks herum erzeugt. Der Aluminiumblock verteilt die Wärme gleichmäßig, so dass es bei langsameren Prozessen keinen Unterschied zwischen der Außenseite und der Mitte des Blocks gibt. Unterschiede werden erst bei Temperaturen über 400 K deutlich. (Autodesk Nastran 2018)

Materialien & Methoden

Komponenten

Software

  • Autodesk Inventor Professional 2019 (Build: 265, Release: 2019.2)
  • Fritzing beta (Ver. 0.9.4 )
  • Arduino IDE 1.8.10 (Board: Arduino Uno, Programmer: AVRISP mkII)

Programmcode

Ergebnisse

Fast fertiggestellt, fehlende Schritte: Aluminiumteile CNC fräsen, Zusammenbau, Tests

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